Pojmy světelného mikroskopu
   

    Mikroskop je optická soustava, určená k pozorování drobných - mikroskopických - objektů při velkém zvětšení až 1000x, případně 1500x. Hranice zvětšení ve světelném mikroskopu je dána vlnovými vlastnostmi světla. Obrazy z mikroskopu pozorujeme zrakem, takže o výsledné kvalitě obrazu rozhoduje nejen technická dokonalost mikroskopu, ale také psychofyziologická kondice uživatele.

Základní díly mikroskopu:

Stativ

Úplný mikroskop se skládá z mechanického tělesa, které tvoří stativ se stolkem, tubusem a osvětlovací soupravou s kondenzorem, a z optických dílů: okulárů a objektivů v otočném revolverovém nosiči. U běžných mikroskopů nejsou jednotlivé díly pevnou součástí stativu, lze je vyměňovat a sestavit tak mikroskop různým způsobem podle požadavků metody, kterou chceme použít. Mluvíme pak o “stavebnicových” mikroskopech. Jednotlivé díly mikroskopů se často nazývají "moduly".

Zaostřování obrazu v mikroskopu se provádí změnou pozorovací vzdálenosti dvojitým souosým knoflíkem na obou stranách stativu mikroskopu. Vnější - větší - knoflík je pro hrubé nastavení, vnitřní - menší - knoflík pro jemné zaostřování. Knoflík jemného posunu bývá opatřen stupnicí, nejmenší dílek odpovídá obvykle posunu o 1µm. Posun může být opatřen nastavitelnou zarážkou, vymezující pohyb ve směru zmenšování pozorovací vzdálenosti - to ulehčuje návrat do roviny ostrosti při výměně vzorků. Rovněž je obvyklé, že můžeme nastavit odpor proti pohybu při zaostřování (samostatným prstencem na společné ose se zaostřovacími knoflíky). Zaostřování se u vzpřímených mikroskopů děje svislým pohybem stolku, při zaostřování inverzních mikroskopů se může pohybovat revolverový nosič objektivů - stolek má pak pro uložení preparátu pevnou základní desku, která je součástí stativu a po ní se pohybuje vodič preparátu.

Stolek mikroskopu slouží pro uložení pozorovaného vzorku do optické osy mikroskopu. Preparáty jsou nejčastěji na standardních podložních sklíčkách (76x26x1mm), bývají většinou zakryty krycím sklíčkem. U krycího sklíčka je nutno dbát na jeho kvalitu, má mít tloušťku přesně 0,17mm, být zcela čiré a planparalelní. Na tloušťku 0,17mm jsou vesměs korigovány objektivy, není-li tato hodnota dodržena, může to mít za následek zhoršení obrazu. Některé dražší objektivy jsou vybaveny korekcí na tloušťku krycího skla. To má význam hlavně u inverzních mikroskopů, kde preparát často pozorujeme přes Petriho misku nebo dno skleněné kultivační nádoby.

Dříve měly jednoduché mikroskopy stolky, opatřené dvěma svorkami, které přidržovaly podložní sklíčko s preparátem - vyhledávání se provádělo ručním posunováním sklíčka po stolku. Moderní mikroskopy mají vodič objektu (vodič preparátu), do kterého se upíná podložní sklíčko (nebo jiný nosič) s preparátem. Posun se provádí po ploše stolku ve dvou osách dvojitým souosým vrubovaným knoflíkem, umístěným většinou na pravé straně stolku tak, aby jej bylo možné pohodlně obsluhovat. Většinou je pohyb možné sledovat na stupnicích s milimetrovým dělením. To usnadňuje vyhledání místa na preparátu.

Vodiče objektu mikroskopů NIKON Eclipse jsou upraveny k současnému uložení až dvou podložních sklíček. Povrch stolku je často vystaven působení různých chemikálií, bývá opatřen odolným nátěrem nebo volitelně keramickou vrstvou. Stolky inverzních mikroskopů jsou upraveny pro uložení velkých objektů - Petriho misek, Terasakiho komůrek nebo kultivačních lahví. Polarizační mikroskopy mají kruhové otočné stolky, opatřené stupnicí (360°).

Tubus je základním dílem stativu a vsazuje se do něho nástavec pro okuláry, vesměs výměnný a upravený pro jeden nebo dva okuláry (monokulární nebo binokulární tubus), případně s dalším optickým výstupem (trinokulární tubus). Na opačném konci je k tubusu je připevněn otočný revolverový nosič objektivů, do kterého se závitem upevňují objektivy. Optická a mechanická délka tubusu patří k základním parametrům mikroskopu.

Osvětlovací souprava se skládá ze síťového transformátoru na 220V/50Hz s regulací výstupního napětí (6 nebo 12 V=), kterým se napájí halogenová žárovka o výkonu 20 až 100W. Mikroskopy s vyšším výkonem žárovky mají samostatnou lampovou skříňku, nutnou pro lepší odvádění tepla, která se ke stativu připevňuje bajonetem. Velké mikroskopy mají v samostatné skříňce také napájecí transformátor. Regulace světelného výkonu žárovky se pak může provádět buď na tomto zdroji, nebo je přenesena do stativu (volitelné). Vzhledem k tomu, že se jen malá část výkonu žárovky promění ve světelné záření a zbytek (kolem 90%) v teplo, je nutné dbát na to, aby kolem lampové skříňky mohl volně proudit vzduch.

Otočný revolverový nosič objektivů může pojmout pět až šest objektivů, které se do něj upevňují závitem. Revolverový nosič je připojen ke stativu buď trvale, nebo je výměnný. Výměnný revolver je výhodný při používání více druhů objektivů, pro metodu DIC je to podmínka (revolverový nosič pro tuto metodu musí být upraven pro zasunutí hranolů).

Kondenzor. Abychom mohli osvětlení v mikroskopu účelně nastavit, je v dráze paprsků osvětlovací soustavy kondenzor, který je součástí osvětlovací soustavy mikroskopu. Rozlišovací schopnost objektivů mikroskopu může být dokonale využita jen tehdy, je-li osvětlení preparátu provedeno pomocí kondenzoru kuželem paprsků o určité nejmenší apertuře.
Kondenzor je umístěn (u vzpřímených mikroskopů) pod stolkem, nesoucím preparát. Bývá většinou svisle posuvný v samostatném pomocném stolku, ze kterého jej lze snadno vyjmout. Důležité je, aby optická osa osvětlovací soustavy procházela středem kondenzoru. Toho dosáhneme přesným vystředěním jeho polohy pomocí středících šroubů. Kondenzor je opatřen irisovou clonou, ovládanou páčkou. V lepším případě se tato páčka pohybuje podél stupnice, udávající numerickou aperturu kondenzoru. Tuto hodnotu potřebujeme ke správnému nastavení. Numerická apertura kondenzoru má být vždy menší, než je apertura objektivu (přibližně 70%). Při nastavování osvětlení (včetně kondenzoru) postupujeme podle návodu, který navrhl Köhler (tzv. Köhlerovo nastavení - je popsáno dále).
Základní typy kondenzorů jsou většinou podle svého konstruktéra jsou označeny jako Abbeho kondenzory, jsou vhodné pro objektivy se zvětšením od 4x až do 100x. Při použití objektivů s malým zvětšením mohou nastat potíže, protože se neosvětlí rovnoměrně celé zorné pole. Pro objektivy s malým zvětšením (2x až 0,5x) jsou k dispozici kondenzory s nízkou numerickou aperturou. Takové kondenzory se však nehodí pro objektivy s velkým zvětšením.
Velmi kvalitní obraz při použití objektivů s olejovou imerzí zajišťují kondenzory pro olejovou imerzi - na ně se - podobně jako na preparát - nanese kapka imerzního oleje, takže paprsky procházejí po výstupu z kondenzoru homogenním prostředím se stejným indexem lomu.
Zvláštní konstrukcí se vyznačují tzv. univerzální kondenzory. Mají vestavěný karusel, ovládaný zvenčí, do kterého jsou vloženy volitelné moduly: fázové prstence, prstenec pro tmavé pole, případně může být tento kondenzor vybaven moduly pro diferenciální interferenční nebo Hoffmanův kontrast.
Vložené prstence jsou obvykle příslušné k objektivu. Pro fázový kontrast bývají označeny jako Ph1, Ph-2 atd., tyto údaje jsou též na fázových objektivech. Podobné prstence se vkládají do kondenzoru při použití Hoffmanova kontrastu. Univerzální kondenzor může být upraven pro diferenciální interferenční kontrast podle Nomarského (DIC). Karusel kondenzoru pro DIC má jinou mechanickou konstrukci, která umožňuje vkládání hranolů.
Pro pozorování v tmavém poli (v zástinu) musí být kondenzor rovněž vybaven doplňkem (clonou) pro tento způsob pozorování.

Inverzní mikroskopy mají optickou soustavu "vzhůru nohama", tj. objektivy jsou pod preparátem a kondenzor s osvětlovací soupravou nad ním. Zde často záleží na tom, aby mezi výstupní čočkou kondenzoru a pozorovaným preparátem byl dostatečný prostor pro manipulaci (např. pro mikromanipulátory). Proto jsou kondenzory a podobně i objektivy u inverzních mikroskopů sestrojeny tak, aby jak pozorovací vzdálenost, tak i vzdálenost mezi preparátem a kondenzorem byly delší, než je běžné. Takové optické prvky bývají označeny LWD (long working distance = dlouhá pracovní vzdálenost), ELWD (extra long working distance), případně i SLWD (super long working distance = mimořádně dlouhá pracovní vzdálenost).

Okuláry a tubusy

Obraz v mikroskopu pozorujeme okulárem. Novější mikroskopy jsou vybaveny tubusem pro dva okuláry (binokulární tubus), takže obraz pozorujeme současně oběma očima. Obraz však u běžného mikroskopu není stereoskopický, protože se díváme přes jeden, oběma okulárům společný objektiv. Pro malá zvětšení jsou používány stereomikroskopy (preparační lupy), které pozorují obraz stereoskopicky současně dvěma samostatnými optickými systémy. Tubus se dvěma okuláry se nazývá binokulární tubus. Pro přesměrování světla do fotografického přístroje nebo televizní kamery jsou určeny tubusy s dalším výstupem, které se nazývají trinokulární tubusy. Mikroskop však může mít pro fotografický přístroj nebo televizní kameru jeden i více samostatných výstupů. Jednoduché trinokuláry dělí světelné paprsky zrcadly, lepší jsou vybavené hranoly. Poměr mezi množstvím světla, které je vedeno do okuláru a do třetího výstupu může být 100-0% a naopak nebo u lepších trinokulárů kromě toho ještě 80-20% i jiný.

Okuláry jsou výměnné. Mohou být rozděleny podle optické konstrukce, podle zvětšení a podle velikosti pozorovaného obrazového pole (které je kruhové). Kritériem pro jakost okulárů je stupeň odstranění tzv. zbytkových vad: barevné vady, sklenutí a astigmatismu. Běžné okuláry mají zvětšení 10x, jsou však okuláry se zvětšením 5x, 12,5x , 15 x a jiné.

Průměr zorného pole v okuláru se zmenšuje se stoupajícím zvětšením. Někdy se této veličině říká "číslo pole" - z anglického "field number" (zkratka "F.N."). Průměr zorného pole je závislý též na objektivu. Dobrý mikroskop má pro okuláry 10x průměr zorného pole kolem 20mm, velmi kvalitní mikroskopy mohou mít průměr zorného pole až 25mm. K zobrazení tak velkého zorného pole jsou nutné tzv. širokoúhlé okuláry (ozn. "UW").

Dobré okuláry mají možnost nastavit dioptrickou korekci pro uživatele, kteří nosí brýle. Zaostření obrazu pak závisí též na nastavení dioptrických korekcí v okulárech. Tato okolnost má vliv na správné zaostření mikrofotografického snímku, nemá-li mikrofotografický přístroj samostatný zaostřovací okulár.

Měření pomocí mikroskopu

Do okuláru se vkládá destička s pomocnou sítí (např. souřadnicové osy X a Y, čtvercová nebo kružnicová síť) nebo měřítko (obvykle 1 mm rozdělený na 100 dílků). Rovněž může být v okuláru fotografická "maska" - rámeček, vymezující obrazové pole snímku. Okulárový mikrometr je samostatná pomůcka, která se vkládá do tubusu místo okuláru a rovněž slouží k měření délek. Pokud nám pro srovnání velikostí stačí relativní hodnoty délek, nemusíme mikroskop kalibrovat. Pro stanovení absolutní velikosti měřených délek potřebujeme ještě objektivové měřítko, kterým pro danou soustavu objektiv - okulár vypočítáme kalibrační faktor. To je číslo, kterým musíme násobit počet dílků okulárového měřítka, abychom dostali měřenou úsečku v jednotkách délky (milimetry, mikrometry atd.).

Binokulární tubus má vždy možnost nastavit podle tvaru hlavy uživatele vzdálenost očních pupil. To je nezbytné, mají-li se obraz, pozorovaný každým okem zvlášť, spojit do jediného obrazu. Některým uživatelům to může činit zpočátku potíže.

Do výstupu pro připojení fotografického přístroje se do trinokulárního tubusu vkládá projektiv, který má mít vlastnosti, zlepšující rovinatost a chromatickou korekci obrazu. Zvětšení v rovině fotografického snímku není shodné se zvětšením v okulárech, bývá větší. Tento rozdíl je u použití televizní kamery pro snímaní obrazu z mikroskopu ještě výraznější a je nutné s ním počítat. Hlavním důvodem pro tuto neshodu je u televizní kamery jednak to, že její čip je obdélníkový a jeho úhlopříčka je kratší, než průměr obrazového pole mikroskopu a pak také to, že se do adaptéru nevkládá projektiv, jako u fotografického nástavce. Vyrábějí se optické adaptéry, které tuto neshodu odstraňují, avšak nejsou levné.

Objektivy

Jsou nejvýznamnější částí mikroskopu, která rozhoduje o jeho kvalitě, jsou objektivy. Jejich vlastnosti prošly dlouhým vývojem - od jednoduché čočky až k dnešním dokonalým objektivům.

OPTICKÝ SYSTÉM Nikon CFI60 pro mikroskopy Nikon ECLIPSE

Na základě dlouholetých zkušeností s objektivy CF provedl Nikon vývoj nových optických systémů, jehož výsledkem jsou objektivy Nikon CFI60 s vlastnostmi, předstihujícími podobné objektivy jiných značek. Tyto objektivy charakterizuje Nikon označením “redefinice nekonečna”. Na trh byly tyto objektivy zavedeny v r. 1997.

Vývoj základních vlastností objektivů Nikon ukazuje tabulka:

Objektivy Nikon CFI60 mají následující významné vlastnosti:

• zdokonalenou kompenzaci zbytkové barevné vady a zdokonalenou rovinatost obrazu
• prodlouženou pracovní vzdálenost
• vyšší numerickou aperturu
• zvětšení 0,5x u objektivu Nikon CFI Macro Plan UW (pro ECLIPSE E800M a E1000M)
• vysokou propustnost pro uv-záření, významné při fluorescenčních metodách a při diferenciálním interferenčním kontrastu (metoda DIC)
• delší paralelní optická dráha paprsků při průchodu tubusem z objektivu do okuláru.

“Nekonečná” délka tubusu je mimo jiné výhodná pro vkládání modulů (fluorescence, mikrofotografie, diskusní zařízení, vložky pro zvýšení polohy okulárů atd.) do stativu mikroskopu mezi objektivy a okuláry. Při vkládání modulů není u této optiky nutné, aby měly další optiku (pomocné čočky).

Objektivy Nikon CFI60 pro pozorování ve světlém poli jsou dodávány v následujících typech:

Objektivy Nikon CFI jsou vyráběny též pro fázový kontrast (CFI Achromát FF, CFI Plan Achromát, CFI Plan Fluor a CFI Plan Apochromát) a pro Hoffmanův kontrast (CFI HMC 10x, CFI HMC 20x F a CFI HMC LWD 40x C).

Optika CFI je doplněna okuláry se zvětšením 10x - 12,5x a 15x se zorným polem až 25mm a projekčními okuláry PLI 2x – 2,5x – 4x a 5x.

Vlastnosti objektivů udávají číselné hodnoty pro zvětšení, numerickou aperturu, parfokální vzdálenost, pozorovací (pracovní) vzdálenost a průměr vstupní / výstupní pupily. Rovněž stupeň odstranění zbytkových vad (aberace) je stejně jako u okulárů důležitým kritériem pro jejich jakost.

Numerická apertura (zkratka n.a.) je součin indexu lomu prostředí mezi vstupní čočkou objektivu a preparátem (krycím sklem) a sinem poloviny otvorového úhlu objektivu. Je měřítkem pro dosažitelnou rozlišovací schopnost objektivu a tím též pro jeho zvětšení a pro světelný tok, který může objektiv zachytit. Numerická apertura je vyryta do objímky na každém objektivu dosahuje u objektivů se zvětšením 100x hodnot až 1,4.

Parfokální vzdálenost je vzdálenost v milimetrech od závitu objektivu k povrchu preparátu, případně krycího skla. Má být pro všechny objektivy na jednom mikroskopu stejná, pak odpadá zaostřování při otáčení revolverovým nosičem. U nových objektivů NIKON CFI60 je tato hodnota 60mm.

Pozorovací (pracovní) vzdálenost se měří od vstupní čočky objektivu k rovině preparátu (krycího skla), se stoupajícím zvětšením klesá až na zlomky milimetru. Některé objektivy mají pozorovací vzdálenost prodlouženou, označují se pak LWD nebo ELDW (jak jsme už zmínili u kondenzorů).

Průměry pupil (vstupní / výstupní) určují numerickou aperturu a tím i jas obrazu. Jsou závislé na parfokální vzdálenosti Delší parfokální vzdálenost dovoluje vyšší numerickou aperturu.

Názvy objektivů se u různých výrobců liší, přesto však mají hlavní skupiny podobné názvy, popisující jejich vlastnosti. Podle toho rozeznáváme:

• achromáty - mají barevnou zbytkovou vadu odstraněnou jen pro dvě barvy, optimální barevná korekce je provedena pro žlutozelenou barvu, na kterou je oko nejcitlivější. Korekce pro modrou a červenou barvu nemusí být tak dokonalá. Achromáty jsou nejekonomičtější objektivy, mohou však být výhodné např. při fluorescenci, protože jsou složeny z méně čoček, takže pohlcují méně ultrafialového záření. Nové objektivy NIKON CFI Achromat FF jsou již dokonale korigovány na rovinatost obrazu (FF znamená "flat field" = rovinaté pole).
• plan-objektivy, např. planachromáty, mají dokonale odstraněnou vadu sklenutí, používají se hlavně pro mikrofotografické práce. Korekce barevné vady je stejná, jako u achromátů.
• apochromáty - mají již provedenou korekci barevné vady pro tři základní barvy spektra. Dosahují vyšší numerické aparatury a lepšího rozlišení pozorovaných detailů.
• planapochromáty spojují vlastnosti apochromátů s plan-objektivy. Patří k nejlepším
  a k nejdražším objektivům.
• fluoritové objektivy, - např. plan fluory (označení objektivů NIKON), využívají vynikajících optických vlastností fluoritového skla, které dobře propouští ultrafialové záření. Používají se hlavně pro speciální účely, např. při fluorescenční mikroskopii. Fluoritové objektivy NIKON plan fluory spojují vlastnosti kvalitních planachromátů s vysokou propustností pro krátkovlnné záření
  a jsou vhodné nejen pro fluorescenci, ale též pro pozorování ve světlém poli. Objektivy NIKON CFI Plan Fluor DLL lze použít pro fázový kontrast, epifluorescenci, světlé pole i pro diferenciální interferenční kontrast.

Barevné označení objektivů. Pro objektivy se vžilo označení barevnými proužky, aby se usnadnila rychlá orientace při otáčení revolverovým nosičem objektivů.

Tak má např. NIKON následující označení:
černá 1x
hnědá 2x
červená 4x
žlutá 10x
zelená 20x
světle modrá 40x
(světle modrá 50x)
kobaltově modrá 60x
bílá 100x

Imerzní objektivy. Objektivy se dále mohou lišit tím, zda jsou “suché” nebo určené pro imerzi. U suchých objektivů je korekce provedena tak, že mezi objektivem a krycím sklem preparátu se předpokládá vrstva vzduchu. K imerzi se nejčastěji používá zvláštní imerzní olej, méně často voda. Imerzní olej má podobný index lomu jako sklo, takže vznikne opticky homogenní prostředí: krycí sklo › imerzní olej › objektiv, ve kterém objektiv zachytí maximum světla, které tvoří obraz v mikroskopu Tento olej má být dobré kvality, předepsaný index lomu má být 1,5130. Dříve často užívaný cedrový olej zanechává nepříjemné zbytky na objektivu. Olejová imerze se používá u objektivů s vyšším zvětšením, nejčastěji u zvětšení 100x.

Podobný - i když slabší - účinek má vodní imerze. Index lomu vody je vyšší, než vzduchu, avšak nižší, než u imerzního oleje. Objektivy pro vodní imerzi mají význam hlavně tehdy, pozorujeme-li objekty, plovoucí ve vodě. Práce s vodní imerzí je méně náročná, objektivy není třeba pracně čistit od imerzního oleje.

Objektivy pro práci bez krycího skla. Dále můžeme rozlišovat objektivy, vyžadující krycí sklo a objektivy pro práci bez krycího skla, označované NCG (no cover glass). Krycí sklo je součástí optické soustavy mikroskopu a musí mít tloušťku, na kterou jsou objektivy korigovány ( 0,17 mm). Rozdíly v tloušťce krycího skla mohou být příčinou pro snížení jakosti pozorovaného obrazu. Objektivy, korigované na práci bez krycího skla se používají hlavně v hematologii. Dokonalejší objektivy jsou vybaveny možností pro korekci na tloušťku krycího skla. Provádí se otočným prstencem na objektivu. Tato korekce má zvláštní význam
u inverzních mikroskopů.

Objektivy s irisovou clonou. Některé velmi kvalitní objektivy mohou být opatřeny irisovou clonou, která má podobnou funkci jako u fotografických objektivů. Vliv zaclonění objektivu mikroskopu na hloubku ostré kresby je však vzhledem k malým pozorovacím vzdálenostem velmi omezený, irisová clona se používá hlavně k omezení světelného toku objektivem.

Optická délka tubusu. Objektivy jsou konstrukčně přizpůsobeny tzv. optické délce tubusu, která se může shodovat s jeho mechanickou délkou. Až donedávna byla optická (a současně i mechanická) délka tubusu u většiny mikroskopů 160mm. V posledních letech se vyrábějí mikroskopy s “nekonečnou” délkou tubusu, které mají četné výhody. Objektivy pro délku tubusu 160 mm nelze používat u mikroskopů s “nekonečnou” délkou tubusu a naopak. Mechanická délka tubusu u mikroskopů NIKON ECLIPSE je 200 mm, optická délka je "nekonečná".

Délka tubusu v milimetrech bývá na objektivech vyznačena číslem (např. 160), případně symbolem pro nekonečno. NIKON například označuje tyto nové objektivy značkou CFI60.

Odpružené objektivy. Výstupní čočka objektivů s velkým zvětšením je při zaostření na preparát velmi blízko krycímu sklu a může dojít k mechanickému dotyku. Proto jsou objektivy s velkým zvětšením vybaveny pružným uložením vstupní čočky, která se při dotyku krycího skla částečně zasune do pouzdra, čímž je objektiv chráněn před poškozením. Takovým objektivům se říká “odpružené”.

Objektivy pro speciální pracovní postupy. Jak jsme se již zmínili, některé metody vyžadují objektivy, upravené pro tyto metody. Sem patří fázový kontrast, Hoffmanův kontrast, případně Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC). Objektivy pro DIC musí být doplněny hranoly v revolverovém nosiči objektivů a v kondenzoru. Dříve bylo pro metodu DIC nutné používat speciální objektivy, avšak NIKON CFI Plan Fluor DLL je univerzální objektiv, který lze použít k běžným postupům i pro tuto náročnou metodu.

Metody různých fázových kontrastů nacházejí svoje uplatnění při pozorování objektů, které nelze barvit, jako např. při fertilizaci in vitro (metoda tzv. asistované reprodukce, umělé oplodňování).

Pozorování v polarizovaném světle. Mikroskop může též sloužit pro pozorování v polarizovaném světle. Tato metoda – pokud se používá pro kvantitativní stanovení polarizačního úhlu – vyžaduje speciální okuláry a objektivy, které nemají vlastní polarizační účinky (bez vnitřního pnutí). Mikroskop musí být doplněn o polarizátor a analyzátor, může být vybaven kruhovým otočným stolkem se stupnicí. Kvalitativní polarizace v procházejícím světle se provádí s běžnými objektivy a s jednoduchou výbavou. K polarizačním mikroskopům se užívají kruhové stolky.

Osvětlovací souprava mikroskopů střední a vyšší kvality je založena na principu Köhlerova osvětlení. Úplné Köhlerovo osvětlení se skládá ze zdroje světla, kolektorové čočky a irisové clony (je to dříve zmíněná polní clona). Pro naše účely stačí nastavit do optimální polohy clonu osvětlovacího systému, clonu kondenzoru (“aperturní” clona) a polohu kondenzoru. Jednoduché stativy mikroskopů mohou být vybaveny jen částečným Köhlerovým osvětlení, většinou nemají polní clonu a kolektorovou čočku.

1. Umístíme preparát a zaostříme s objektivem 1:20.

2. Uzavřeme clonu svítícího pole (polní clona).

3. Kondenzor zvyšujeme nebo snižujeme tak dlouho, až je obraz svítícího pole ostře ohraničený. To nastává většinou v případě, když je kondenzor značně vysoko.

4. Obraz svítícího pole posuneme (centrovacími šrouby kondenzoru) do středu zorného pole

5. Clonu svítícího pole (polní clonu) otevřeme tak, až se okraje jejího obrazu právě shodují s okrajem zorného pole.

6. Vyjmeme z tubusu okulár a pozorujeme clonu kondenzoru (aperturní clonu), kterou uzavřeme tak, aby zůstalo osvětleno ještě 2/3 průměru výstupní clony objektivu.

Nemá-li mikroskop polní clonu, nastavujeme jen polohu kondenzoru a aperturní clonu. Kondenzor může být pevně uložen při výrobě, pak toto nastavení odpadá.

Barevné a neutrální filtry. Součástí osvětlovací soustavy jsou filtry, které se vkládají do dráhy světla. Mohou se pokládat na výstupní čočku osvětlovací soustavy ve stativu mikroskopu, nasazovat na kondenzor nebo jsou uloženy ve stativu a vkládány pomocnými mechanizmy (páčkou apod.).

Filtry můžeme rozdělit na pestré (barevné) a nepestré (neutrálně šedé). Barevné filtry mění chromatičnost pozorovaného obrazu. Běžný je modrý filtr, používaný při pozorování i při fotografické dokumentaci (označený běžně jako filtr pro "denní světlo") a zelený interferenční filtr (označovaný zkratkou "GIF"), velmi prospěšný při pozorování ve fázovém kontrastu. Nepestré - neutrálně šedé -filtry slouží k zeslabení intenzity osvětlení (podobně jako "polní" clona), přitom se však nemění chromatičnost. NIKON označuje tyto filtry počátečními písmeny ND ("neutral density").

Kromě těchto filtrů se používají také filtry, absorbující tepelné záření.

Pozorování v tmavém poli (v zástinu): Při pozorování v tmavém poli je z obrazu vyloučeno světlo, které by dopadalo přímo do objektivu. Prázdné zorné pole je při tomto postupu tmavé. Teprve to světlo, které se rozptýlí při dopadu na preparát, prochází částečně objektivem a vytváří obraz objektu, složený ze zářících bodů. Pro suché objektivy s numerickou aperturou do 0,65 není třeba zvláštních kondenzorů pro tmavé pole, stačí zastínit výstupní čočku kondenzoru clonou pro tmavé pole, která je ve volitelné výbavě mikroskopu. Protože se při tomto pozorování využívá jen zlomku světlené intenzity zdroje, má mít tento zdroj dostatečný výkon. Z hlediska světelné optiky je důležité, že při pozorování v tmavém poli září na tmavém podkladě ty části objektu, na kterých dochází ve vlastnostech světla k dostatečnému rozdílu při průchodu pozorovaným objektem, jako např. na hranách. Při tvorbě obrazu v tmavém poli nemají význam rozdíly v indexu lomu, které jsou podstatné při pozorování ve fázovém kontrastu.

Pozorování ve fázovém kontrastu: Fyzikální principy fázového kontrastu nejsou snadno přístupné. Naopak praktické používání fázového kontrastu ve světlené mikroskopii nečiní většinou žádné potíže. Stručně můžeme říci, že po průchodu preparátem se světlo mění dvěma způsoby: změna amplitudy procházejícího světla nám zprostředkuje vnímání detailů kontrastů jak intenzity, tak i barev. Výsledný vjem je běžný kontrastní barevný obraz. Změna fáze světla, která nastává při průchodu objektem, není zrakem přímo viditelná. Nemá-li tedy objekt detaily, lišící se kontrastem, je pro lidský zrak průhledný, čirý. U řady biologických objektů tyto vlastnosti převažují a proto je zrakem obtížně identifikujeme. Mikroskop, vybavený pro pozorování ve fázovém kontrastu, nám umožňuje pozorovat i takové objekty, které způsobují jen fázový posun světla. Hlubší poznatky o tomto principu jsou součástí fyzikální optiky.

Mikroskop pro pozorování ve fázovém kontrastu musí být pro tuto metodu vybaven. Potřebujeme objektivy pro fázový kontrast a kondenzor pro fázový kontrast. Oba tyto optické díly jsou opatřeny tak zvanými fázovými prstenci. U objektivů jsou jejich trvalou částí, u kondenzoru jsou používány podle potřeby. Objektivy pro fázový kontrast mají na jedné ze svých čoček nanesený neprůhledný "fázový" prstenec, na kterém nastává posun fáze světelné vlny. Objektivy pro fázový kontrast mohou sloužit též pro pozorování bez fázového kontrastu, avšak prstenec v objektivu způsobuje v tomto případě mírné snížení jakosti obrazu - udává se přibližně 10 %. U objektivu s malým zvětšením se toto zhoršení prakticky neprojevuje.

Fázový kontrast je značně závislý na seřízení mikroskopu. K tomu se dodává účelná pomůcka, tzv. středící (centrovací) dalekohled. Ten se nasadí místo jednoho okuláru a pak pozorujeme polohu fázových prstenců, které můžeme vystředit pomocí nastavovacích prvků. Přesný postup je v návodu ke každému mikroskopu, nicméně vyžaduje trochu zkušeností. Je běžné používat pro světlé pole a fázový kontrast společné objektivy až do zvětšení 40x, pro vyšší zvětšení je téměř nutné používat pro každou metodu jednoúčelový objektiv.

Kondenzor pro fázový kontrast bývá u jednoduchých mikroskopů vybaven tzv. šoupátkem, nesoucím 1 nebo 2 fázové prstence. Tyto fázové prstence jsou svým tvarem přizpůsobeny vždy objektivu s určitým zvětšením. Dokonalejší mikroskopy jsou vybaveny univerzálním otočným kondenzorem, vybaveným třemi fázovými prstenci, prstencem pro pozorování v tmavém poli a otvorem pro pozorování ve světlém poli. Volba se provádí otáčením karuselu, nesoucím jednotlivé prstence. Pozorování při fázovém kontrastu se podstatně zlepší, použijeme-li zelený interferenční filtr. Tento filtr propouští zelené světlo vlnové délky kolem 540nm, které zvyšuje vjem kontrastů. Oko je na tuto vlnovou délku světla maximálně citlivé.

Fluorescenční mikroskopie

Fluorescenční mikroskopie se dělí na dvě metody: pozorování v odraženém světle (epifluorescence) a pozorování v procházejícím světle (diafluorescence). Fluorescenční pozorování v procházejícím světle se v současné době téměř nepoužívá, pod pojmem fluorescence budeme rozumět výhradně pozorování odraženého fluorescenčního světla, tj. epifluorescenci.
Podstatou fluorescence je buzení viditelného záření v objektech, které obsahují chemické sloučeniny (fluorochromy), schopné specificky měnit dopadající ultrafialové záření na “odražené” barevné viditelné záření. Některé biologické objekty již takové sloučeniny samy obsahují (např. chlorofyl), jiným je musíme dodávat specifickým barvením. Takové preparáty jsou často zdrojem viditelného záření pouze dočasně.

Pro fluorescenci potřebujeme samostatnou osvětlovací soustavu. Jednak musí světlo dopadat na objekt (podstata epifluorescence) a za druhé musí mít určitou vlnovou délku, často z oblasti ultrafialového záření. Výbava mikroskopu pro fluorescenci se skládá ze zdroje záření, nástavce pro osvětlení dopadajícím světlem, držáku s výměnnými fluorescenčními filtry a ochranného oranžového štítu.

Zdrojem záření je téměř vždy vysokotlaká rtuťová výbojka, méně často halogenová žárovka. Výbojka je napájená ze sítě přes samostatný zdroj ze sítě 220V/50H, obecně zvaný “startér”. Je umístěna v lampové skříňce, která souvisí s nástavcem pro osvětlení dopadajícím světlem. Tyto díly je nutné stavebnicově vsadit do stativu mikroskopu, současně s držákem fluorescenčních filtrů. Výbojku v lampové skříňce je nutné vystředit a zaostřit tak, aby její světelný tok při dopadu na preparát byl maximální. To se provádí pomocí kolektorové čočky a středících šroubů na lampové skříňce při pozorování obrazu výboje ve středící pomůcce, která se upevní místo jednoho objektivu v revolverovém nosiči. Dokonalé vystředění výbojky je podmínkou pro dobrý výsledek a je nutné občas kontrolovat. Výbojka má životnost kolem 200 h, délka jejího života se měří hodinovým počitadlem na startéru. Život výbojky může být i delší, po překročení mezní doby nehrozí imploze, avšak uvnitř výbojky se usazuje kovový nálet, který snižuje její světelný výkon.

Důležitou součástí fluorescenční výbavy jsou fluorescenční filtry. Fluorescenční filtr je obvykle vyroben jako “kostka”, která se skládá z excitačního filtru, závěrného filtru a dichroického zrcadla. Filtry se od sebe liší vlnovými délkami, které vymezují pásma propustnosti excitačního a závěrného filtru. Dichroické zrcadlo odráží přednostně krátkovlnné záření na preparát a propouští dlouhovlnné "fluorescenční" záření do okuláru. Pro praxi je důležité, že ke každému fluorescenčnímu barvivu je nutné přiřadit určitý fluorescenční filtr (mluvíme o jednom filtru, ačkoliv jde o soustavu dvou filtrů a zrcadla v kostce). Výrobci nabízejí množství různých filtrů, některé z nich jsou i vícepásmové. Metodiky práce předepisují určitá barviva a k ním specifické filtry, takže uživatel má ušetřenou namáhavou a finančně náročnou práci s jejich zkoušením. Běžné filtry jsou označeny písmenem, určujícím barevnou oblast světla (B = modrá, G = zelená), ve které pracují. Čísla v označení pak charakterizují pásma vlnových délek pro závěrný a excitační filtr, případně pro dichriocké zrcadlo. NIKON zveřejnil obsáhlou tabulku, ve které jsou k jednotlivým barvivům (fluorochrómům) uvedeny doporučené filtry, popsané kódovým označením výrobce (názvem) a vlnovými délkami budících a závěrných filtrů. Volba správného filtru je podstatnou podmínkou pro úspěšnou metodiku fluorescenční mikroskopie.